要約：RNA干渉（RNAi）を新型治療戦略として慢性B型肝炎治療に用いる

世界には約2億9000万人の慢性B型肝炎ウイルス感染者がおり、既存のヌクレオチド（酸）類似物とインターフェロン系薬物は長期的には終生投与や耐性の問題、および現段階の機能性治癒目標を実現できることが極めて少ないため臨床需要を満たすことができず、新型作用機序薬物の開発が急がれている。

現在、慢性B型肝炎治療のための様々な新しい作用機序薬が臨床開発されており、ウイルス進入抑制剤、ポリメラーゼ抑制剤、RNA沈黙療法、衣殻組立調整剤、ウイルス蛋白輸送抑制剤、ファニニトールX受容体作動薬（FXR）、治療ワクチン、遺伝子編集技術などが含まれる。

その中でRNA沈黙（RNAi）療法は上述の多くの治療法の中で比較的に早く開発され、有望な臨床結果を示した治療法である。RNAiは、転写後のHBV mRNAを標的化するために同源ヌクレオチド鎖を使用することに関連し、それによって下流ウイルスタンパク質の産生を抑制する。RNAiはHBsAg血清除去を予測する重要な代替結果であるHBsAgを低レベルに抑制することができる。RNAiによるHBsAgの減少により、T細胞機能が逆転され、宿主免疫反応の再構築が実現される可能性がある。

香港大学医学院のMan-Fung Yuenチームはこのほど、遅いB型肝炎治療のための新しい治療法としてRNAiを用いた総説を発表した。この総説では、研究者は遅いB型肝炎治療のためのRNAiのメカニズムと証拠を回顧した。薛節はこの総説の一部を選んで各位と共有し、以下は内容の詳細である

RNA干渉（RNAi）

RNAi作用機序

RNA干渉（RNA interference、RNAi）とは、進化過程において高度に保存され、二本鎖RNA（dsRNA）によって誘発される、相同性mRNAの高効率特異的分解の現象を指す。1998年、FireらはGuoらが発見した正義のRNAが相同性遺伝子の発現を抑制する現象は、体外転写により調製されたRNAに微量の非符号化二重鎖RNA（dsRNA）が汚染されていることに起因していることを確認し、この非符号化二重鎖RNAを小干渉RNA（siRNA）と命名し、この現象をRNAiと命名した。

siRNAは正義鎖とアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖はターゲットmRNAに相補的である。siRNAは細胞呑み込み作用により細胞質に入り、その後Dicer（RNase IIIヌクレオチダーゼ）、Argonaute（RNase）及びトランス活性化効果素子RNA−結合蛋白（RNA−binding cofactor）と相互作用し、RISC（RNA誘導サイレント複合体）複合体（RLC）を形成し、さらにsiRNA誘導鎖と相補配列を有する標的mRNAと結合できるRISCを形成する。RISCが標的mRNAと結合すると、RISCは生物によって異なる可能性がある様々なメカニズムを通じて遺伝子沈黙を誘導する。

RNAiはウイルス性感染症に対する治療法として用いられている

2018年に米FDAが遺伝性トランスサイロキシンタンパク質のアミロイド変性を標的とするsiRNA療法Patisiranを承認し、その後、siRNA療法の分野が急速に拡大した。現在、ウイルス感染、遺伝病、心不全、慢性腎症、悪性腫瘍など、さまざまな疾患への応用が研究されている。

現在、siRNAは、慢性B型肝炎やヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染などの現在の治療では解消できない慢性ウイルス感染、呼吸器合胞ウイルス、ポリオウイルス、エボラ出血熱ウイルスなどの有効な治療法のないウイルス感染に使用されることが研究されている。

siRNA抗ウイルス薬を開発するための重要な考慮事項の1つは適切な配列選択である。選択されたRNA配列は、標的ウイルスゲノム中の保存配列に高度な特異性を持つべきであり、それによって汎遺伝子型抗ウイルス作用を発揮することができる。特定のsiRNA配列はまた、宿主ゲノムに対する脱標的効果を減少させることができ、それによって不良薬物毒性を回避することができる。siRNAは一般に長さが約21〜23 bpであり、3'末端には2つのヌクレオチドが突出している。長い配列は脱標的効果のリスクを高めるためである。

構造最適化はsiRNA抗ウイルス薬にとって重要である。天然に存在するヌクレアーゼにより、未修飾siRNAはヒト血清中で急速に分解される。また、未修飾siRNAはリン酸塩骨格とアニオン電荷の存在により親水性であり、負電荷を持つ細胞膜を介して拡散することはできない。その後、siRNAは免疫刺激作用を有し、二本鎖RNA依存性蛋白質キナーゼとToll様受容体により不要な非特異的インターフェロン反応を誘導することができる。

siRNAリン酸骨格の化学修飾は、siRNA不安定性、細胞進入、不測の免疫活性化の3つの課題を解決することができる。リン酸骨格上に2′−O−メチル基または2′−F−ヌクレオチドを2′−OH基に置換することにより、血清ヌクレオチド酵素の影響からsiRNAを保護し、脱標的効果を減少させ、不要な免疫刺激反応を大きく減少させることができ、同時に、効力が500倍向上した。

現在、ウイルスと非ウイルスベクターが標的細胞にsiRNAを運ぶことが研究されており、非ウイルスベクターにはポリマー、アプタマー、ペプチド、リポソーム、抗体、脂質ナノ粒子が含まれており、アデノウイルスベクターは毒性がなく、生産が容易であり、ワクチンへの応用に十分な経験があるため、一般的なウイルスベクターである。さらに、送達システムの選択は、必要なsiRNAターゲットにも依存する。例えば、N−アセチルガラクトシルアミン（GalNAc）は肝臓ガイドsiRNAの理想的な選択である。GalNAcは脱シアル酸糖蛋白受容体（ASGPR）と結合し、肝細胞にはASGPRが豊富で特異性を兼ね備えているからである。

B型肝炎ウイルスに対するRNA干渉療法の設計

HBVの特徴はその4つの開放読取枠（ORF）にあり、それぞれB型肝炎前コア/コア、ポリメラーゼ、表面とXタンパク質をコードする。4つのORFは重複配列を有し、コアタンパク質コード領域の3'末端に同じポリアデニル化信号を有する。これにより、単一のsiRNAがすべての4種類のHBV転写物を妨害することができ、それによってすべての下流ウイルスタンパク質と前ゲノムRNAの生成を減少させることができる。ウイルス複製もsiRNAによって減少し、これは間接的にcccDNAリポジトリを減少させる可能性がある。したがって、siRNAはウイルスのライフサイクルの複数のステップを直接的または間接的に干渉することができる。次の図は、HBVに対するRNAiのメカニズムを示しています。

HBVに対するsiRNAを設計する際、ウイルス突然変異は1つの塩基ミスマッチがsiRNA効果の喪失を引き起こす可能性があるため、考慮すべき問題である。RNAウイルス（HIVとHCVを含む）では、siRNA処理後に突然変異株が急速に出現することが報告されている。しかし、現在のところ、siRNAがHBV突然変異を誘導するという報告はないが、siRNAは予め存在する耐性HBV準種に選択圧力を加えることができる。siRNA治療における標的機能の重要性および保存領域の使用、または複数のsiRNAトリガの使用は、HBV突然変異の潜在的な影響を大幅に低減するために重要である。

siRNAはまた、HBVに対する宿主の免疫反応を回復することができる。HBVが慢性的に存在し続ける主な要因の1つは、高レベルの免疫抑制性ウイルス抗原（特にHBsAg）に長期間暴露した後の宿主免疫抑制である。CHBは宿主免疫経路の損傷に関連し、Toll様受容体信号伝導、免疫検査点信号伝導、免疫抑制性Tを増加させて細胞活性を調節することを含む。これらの作用は最終的にHBV特異性T細胞クローンの減少と機能障害をもたらし、T細胞の数と機能上の抗HBV欠陥をもたらした。HBVウイルス抗原を減少させる上でのそれの効果により、siRNAは間接的に免疫系を再建することができる。

アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子沈黙の別の形態

まず、siRNAは二本鎖RNAであり、理想的な長さは21ヌクレオチドに2つの3'末端突出ヌクレオチドを加える。対照的に、ASOは長さ15〜25ヌクレオチドの単鎖DNAである。ASOはGapmer構造として設計され、中央の非修飾相補DNA配列の両側は修飾RNA様断片である。Gapmer構造は、ターゲット配列に対するASOの親和性を高め、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗力を高める。

第二に、非修飾siRNAは細胞に入るためにベクターを必要とし、非結合ASOは受容体媒介経路を介して肝細胞に吸収される。細胞に入ると、siRNAは核内体中に蓄積され、投与頻度は少ないが、ASOは細胞質中に蓄積され、より頻繁な投与が必要である。ASOはベクター修飾を必要としないが、ASO中のGalNAc修飾は肝細胞取り込みを強化し、全身暴露を減少させることができ、siRNA中のGalNAc修飾の効果と類似している。

第三に、siRNAは標的mRNAと結合するためにRISCを形成する必要がある。なぜなら、正義鎖の除去はアンチセンス鎖上の相補的ヌクレオチドの暴露に不可欠であり、ASOは標的mRNAと単独で結合することができるからである。

第四に、siRNAとASOは異なる遺伝子沈黙機構を持っている。上述したように、siRNAはRISCによってその役割を媒介する。対照的に、ASOは、細胞質および細胞核においてRNase−H（リボヌクレアーゼファミリー）を募集することによって標的RNAを切断することによってその役割を媒介することが最も多い。ASOはまた、5'キャップ形成を抑制するか、リボソームサブユニット付着を遮断することによってRNA翻訳を抑制することができる。

慢性B型肝炎の臨床前と臨床証拠

この総説では、RNAi系薬物にはARC-520、ARB-1467、AB-729、RG-6346(DCR HBVS)、VIR-2218（BRII-835）、JNJ-3989（ARO-HBV）、ALG-125918、ALG-125755，アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）系薬物としては、RO 7062931、GSK3389404、Bepirovirsen (GSK3228836，GSK836) 、ALG-020572，及びVIR-2218の併用薬、JNJ-6379の併用薬、ALG-125755 (siRNA) + ALG-020572 (ASO)、 ALG-125903 (siRNA) + ALG-020579 (ASO) + ALG-010133。上述の薬物に関するデータは薛氏がこれまで肝臓時間の微信公衆番号の歴史的内容の中でほとんど発表されていたため、ここでは詳細については触れないが、見たい友人は自分で歴史的内容に関連薬物名を入力して見ることができる。

現在の証拠と結論の概要

既存の臨床試験では、siRNAは一般的に安全であり、ほとんどの有害事象は軽微な注射反応またはインフルエンザ様症状であることが一致して確認された。ALTの急激な上昇はsiRNA治療において発生することができるが、通常は短く、HBsAgの低下に関連しており、免疫再建と感染肝細胞の除去を示唆している。

siRNAはHBsAgを低減する効果を示している。次世代siRNA（旧世代ARC−520およびARB−1467を除く）において、HBsAgの平均低下は2−2.5 logであり、高用量治療群では90%を超える患者が1 log IU/mlを超えるHBsAgの低下に達し、50−97%の患者HBsAgが100 IU/ml以下に抑制された。治療終了後のsiRNAにおけるHBsAgの低下は持続可能であり、HBsAg血清学的クリアランスの発生率が記録されている。

それでも、これらの効果的なHBsAg低下効果が持続的なHBsAg血清学的クリアランスに変換できるかどうかは不明である。さらに、HBeAg陽性患者と陰性患者のより大規模な研究を比較して、薬物作用が異なるCHBサブグループに普及できるかどうかを決定する必要がある。現在、異なるCHB群からの試験の長期データが期待されている。

現在のsiRNAの標準投与案は複数回投与であり、複数回投与は単回投与よりHBsAgを低下させ、効果が持続するためである。現在の証拠はsiRNAが月1回投与できることを支持しており、AB-729は8または12週間おきに投与しても有効な投与効果を示している。

siRNAの総投与期間（総治療期間）は、現在の試験では異なる治療期間（2ヶ月から1年まで異なる）が採用されているため、現在も明確ではない。理想的な治療期間の決定は、治療後のHBsAg抑制の持続性に依存する可能性があり、HBsAg血清学的クリアランスを監視するためには、より長い追跡試験が必要である。これらの問題はRNAi療法の将来の発展に重要な意義を持っている。

siRNAと同様に、ASOも一般的に安全で耐性が良い。siRNAは月に1回投与することができるが、ASOはより頻繁な投与（週または2週間に1回）を必要とし、これはsiRNAとASOの間に固有の薬物動態の違いを反映している。

すべての患者において機能的治癒を達成するためにRNAiを他の新規抗ウイルス薬と結合する必要があるかどうかを決定する前に、RNAiによって低HBsAgレベル（例えば、<100 IU/mL）に達した患者がその後HBsAg血清学的に除去される可能性を決定する必要がある。RNAiを停止してから短時間でHBsAg血清クリアランスがかなり高い場合は、RNAiを他の異なる種類の新薬と併用する必要はない可能性があります。しかし、依然として高いHBsAgレベルを有する患者には、併用治療が必要である可能性がある。

NAの既定の効果と安全性に伴い、将来のRNAi治療案はNAを基石とする可能性がある。RNAiおよびNAに第3の抗HBV薬を添加すると、相乗的な抗ウイルス作用が生じる可能性がある。

RNAiは免疫再建の潜在的な役割を持つため、免疫調節剤の添加は宿主の抗ウイルス免疫システムをさらに増強する可能性がある。実際には、VIR−2218とポリエチレングリコール化インターフェロンα−2 aとを組み合わせて使用することは、いずれの薬物を単独で使用するよりも大きなHBsAg抑制をもたらすことができる。現在のデータは、siRNAとインターフェロンを結合することで相乗効果が得られることを示している。

それでも、siRNAと免疫調節剤（siRNA＋治療ワクチンとsiRNA＋Toll様受容体アゴニストを含む）の他の組み合わせ案は臨床試験研究を行っている。siRNAと新型ウイルス標的製剤との併用投与の研究も行われている。

注目すべきは、臨床前実験により、siRNAとASOの2つの共有同一ターゲット（mRNA）のRNAサイレンサーを結合する際に相乗効果があることを証明したが、この組み合わせの潜在的なメカニズムと臨床治療効果はまだ確定していない。

一方、siRNAとケーシング組立調整剤の組み合わせは、進行中の試験では相乗効果が得られなかった。これは、siRNAと組み合わせた薬物を慎重に選択する必要性を際立たせ、異なるメカニズムを有する薬物に関する一連の組み合わせ試験が依然として行われている。

要するに、RNAiは有効で持続可能なHBsAg抑制を誘導する安全な技術である。RNAiの研究は急速に発展しており、早期データが有望である。複数の試験が進行中であり、さらなる発展に伴い、RNAiはCHB治療のパラダイムを変える新しい治療戦略になる可能性がある。